Репрограммирование клеток замедляет старение

Временная неинтегративная экспрессия факторов ядерного перепрограммирования способствует многогранному омоложению клеток человека

Авторы и участники исследования: Тапаш Джей Саркар, Марко Кварта, Шравани Мукерджи, Алекс Колвилл, Патрик Пейн, Линда Доан, Кристофер М. Тран, Констанс Р. Чу, Стив Хорват, Лей С. Ци, Нидхи Бутани, Томас А. Рандо и Витторио Себастьяно

Аннотация

Старение характеризуется постепенной потерей функции клетки, происходящей на молекулярном, клеточном, тканевом и организменном уровнях. На уровне хроматина старение ассоциируется с прогрессирующим накоплением эпигенетических ошибок, которые в конечном итоге приводят к аберрантной регуляции генов, истощению стволовых клеток, старению и нарушению гомеостаза клеток / тканей. Ядерное перепрограммирование к плюрипотентности может вернуть как возраст, так и идентичность любой клетки к таковой эмбриональной клетки.

Последние данные показывают, что временное перепрограммирование может улучшить возрастные признаки и продлить продолжительность жизни у прогероидных мышей. Однако неизвестно, как эта форма омоложения будет применяться к естественным образом состарившимся клеткам человека. Здесь мы показываем, что временная экспрессия факторов ядерного перепрограммирования, опосредованная экспрессией мРНК, способствует быстрому и широкому улучшению клеточного старения, включая восстановление эпигенетических часов, уменьшение воспалительного профиля в хондроцитах и ​​восстановление юношеского регенеративного ответа у пожилых, стволовые клетки мышц человека, в каждом случае без отмены клеточной идентичности.

Процесс ядерного перепрограммирования в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) после завершения характеризуется глубоким сбросом эпигенетического ландшафта клеток происхождения, что приводит к возвращению как клеточной идентичности, так и возраста в эмбрионоподобное состояние.

Примечательно, что если выражение факторов перепрограммирования применяется только временно, а затем останавливается (до так называемой точки невозврата, PNR), клетки возвращаются в исходное состояние соматической клетки. Эти наблюдения показывают, что при применении в течение достаточно короткого времени экспрессия факторов перепрограммирования не может стереть эпигенетическую сигнатуру, определяющую идентичность клеток; однако остается неизвестным, можно ли достичь какого-либо существенного и измеримого перепрограммирования клеточного возраста до PNR.

Первое доказательство того, что временное перепрограммирование может способствовать улучшению фенотипов старения, было показано Ocampo et al., у прогероидных мышей, несущих индуцируемую Dox кассету OSKM. Тем не менее, важные вопросы остаются открытыми. Мышиные генетические модели преждевременного старения лишь частично повторяют сложность естественного старения, феномен, который характеризуется медленным и прогрессирующим накоплением эпигенетических ошибок. Кроме того, отсутствуют доказательства того, что тот же омолаживающий эффект может быть достигнут с помощью клеток человека естественного возраста, выделенных из пожилых людей, вместе с комплексным молекулярно-физиологическим анализом глубины и степени омоложения в клетках человека. Чтобы ответить на все эти вопросы, мы разработали платформу, которая позволила бы нам протестировать, оказывает ли временная экспрессия генов ядерного перепрограммирования какое-либо влияние на улучшение фенотипов старения в естественно состарившихся клетках человека и мыши через несколько типов клеток и охватывая все признаки старения.


Сначала мы оценили влияние временной экспрессии факторов репрограммирования на транскриптом двух разных типов клеток - фибробластов и эндотелиальных клеток - у пожилых людей и сравнили его с транскриптомом тех же типов клеток, выделенных у молодых доноров:

Рис. 1: Анализ транскриптомных и эпигенетических часов показывает более молодую сигнатуру при временной экспрессии OSKMNL в фибробластах человека и эндотелиальных клетках.

a Диаграммы Венна показывают дифференциально экспрессируемые гены в фибробластах (молодые, n = 3 человека; в возрасте и в возрасте, получавшие лечение n = 3 человека), определенные при значении р> 0,05 и изменении логарифмической кратности> 0,5. Сравнение между тремя группами проводилось с помощью теста ANOVA.

b Схема протокола перепрограммирования.

c График вулкана, показывающий экспрессию генов дифференцировки генов молодых и старых фибробластов.

d Тепловая карта полярности экспрессии (зеленый = вверху, фиолетовый = внизу) - среднее значение для каждого дифференциального гена. Распределение показывает, что обработанные образцы переходят в экспрессии в этом пространстве в направлении молодых фибробластов. Клетки в каждой когорте подвергались парному считыванию РНК секвенирования по 80 п.н. и квантили нормализовались.

e Диаграммы Венна показывают дифференцированно экспрессируемые гены в эндотелиальных клетках (молодые, n = 3 особи; пожилые и обработанные возрастом n = 3 особи), определенные при значении р> 0,05 и изменении логарифмической кратности> 0,5. Сравнение между тремя группами проводилось с помощью теста ANOVA.

f График вулкана, показывающий дифференциальную экспрессию генов у молодых и старых эндотелиальных клеток.

g Тепловая карта полярности экспрессии (зеленый = вверху, фиолетовый = внизу) - среднее значение для каждого дифференциального гена. Распределение показывает, что обработанные образцы переходят в экспрессии в этом пространстве в направлении молодых эндотелиальных клеток.

h Оценка времени метилирования по возрасту образца пациента с и без лечения для фибробластов; n = 4 человека.

i Оценка часов метилирования по возрасту выборки пациентов с эндотелиальными клетками и без них; n = 4 человека. Статистический анализ часов метилирования был выполнен с помощью двустороннего t-критерия анализа.

Фибробласты были получены из биоптатов кожи рук и живота (25–35 лет для молодой группы, n = 3 и 60–90 лет для пожилой группы, n = 8), тогда как эндотелиальные клетки были извлечены из подвздошной вены и артерии (15 –25 лет для молодой группы, n = 3 и 50–65 лет для пожилой группы, n = 7). Мы использовали неинтегративный протокол перепрограммирования, который мы оптимизировали на основе набора мРНК, экспрессирующих OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 и NANOG (OSKMLN).

Наш протокол последовательно производит колонии ИПСК, независимо от возраста доноров, после 12–15 ежедневных трансфекций; мы пришли к выводу, что PNR в нашей платформе происходит примерно на 5-й день репрограммирования, основываясь на наблюдении, что первая обнаруживаемая экспрессия эндогенных связанных с плюрипотентностью lncRNAs происходит на 58-й день. Поэтому мы приняли временную схему экзогенной экспрессии, при которой OSKMLN ежедневно трансфицировали в течение 4 дней подряд и проводили анализ экспрессии гена через 2 дня после прерывания.

Мы провели парное массовое РНК-секвенирование для обоих типов клеток для одних и тех же трех групп: молодые (Y), необработанные в возрасте (UA) и обработанные в возрасте (TA). Во-первых, мы сравнили квантильные нормализованные транскриптомы молодых и необработанных состарившихся клеток для каждого типа клеток (Y против UA) и обнаружили, что 961 ген (5,85%) в фибробластах (678 положительных, 289 отрицательных) и 748 гены (4,80%) в эндотелиальных клетках (389 с положительной регуляцией, 377 с пониженной регуляцией) различались между молодыми и пожилыми клетками, с критериями значимости p<0,05 и срезом изменения логарифмической кратности ± 0,5. Мы обнаружили, что эти наборы генов были обогащены для многих из известных причин старения, определенных в коллекции наборов генов отличительных признаков в базе данных молекулярных сигнатур.

Когда мы картировали направленность экспрессии выше или ниже среднего значения каждого гена, мы могли наблюдать явное сходство между обработанными и молодыми клетками в отличие от старых клеток как для фибробластов, так и для эндотелиальных клеток. Кроме того, мы провели анализ главных компонентов в этом пространстве генного набора и определили, что молодые и пожилые популяции были разделены вдоль первого главного компонента (PC1), что объясняло 64,8% дисперсии в фибробластах и ​​60,9% дисперсии в эндотелиальных клетках. Интересно, что обработанные клетки также сгруппировались ближе к более молодым клеткам, чем старые клетки, просто вдоль PC1.

Используя те же критерии значимости, которые были определены выше, мы затем сравнили обработанные и необработанные пожилые популяции (TA и UA) и обнаружили, что 1042 гена в фибробластах (734 активированы и 308 с пониженной регуляцией) и 992 в эндотелиальных клетках (461 с усиленной регуляцией и 531 с пониженной регуляцией) были дифференцированно экспрессированы. Интересно, что и в этих наборах генов мы обнаружили обогащение путей старения в базе данных молекулярных сигнатур, как описано ранее.

Когда мы сравнили профили молодых и необработанных пожилых (Y против UA) и необработанных пожилых и обработанных пожилых (UA против TA) в каждом типе клеток, мы наблюдали совпадение фибробластов на 24,7% (отношение шансов 4,53, р <0,05) и 16,7% перекрываются для эндотелиальных клеток (отношение шансов 3,84, р <0,05) с направленностью изменения экспрессии генов, совпадающей с таковой у молодежи (т. е. если выше у молодых, то выше у обработанных пожилых людей); менее 0,5% двигались в противоположном направлении в ячейках обоих типов.

Затем мы использовали эти транскриптомные профили для подтверждения сохранения идентичности клеток после лечения. С этой целью, используя установленные маркеры идентификации клеток, мы убедились, что ни один из них существенно не изменился после лечения. Кроме того, мы не смогли обнаружить экспрессию каких-либо маркеров, связанных с плюрипотентностью (кроме мРНК OSKMLN). В целом, анализ транскриптомных сигнатур показал, что экспрессия OSKLMN способствует очень быстрой активации более молодого профиля экспрессии генов, который специфичен для типа клеток, без влияния на экспрессию генов клеточной идентичности.

Эпигенетические часы, основанные на уровнях метилирования ДНК, являются наиболее точными молекулярными биомаркерами возраста в тканях и типах клеток и являются прогностическими для множества связанных с возрастом состояний, включая продолжительность жизни. Известно, что экзогенная экспрессия канонических факторов репрограммирования (OSKM) возвращает эпигенетический возраст первичных клеток в пренатальное состояние.

Чтобы проверить, может ли временная экспрессия OSKMLN обратить вспять эпигенетические часы соматических клеток человека, мы использовали два эпигенетических часа, которые применяются к фибробластам и эндотелиальным клеткам человека: оригинальные пан-тканевые эпигенетические часы Horvath (основанные на 353 парах цитозин-фосфат-гуанин), и более поздние кожно-кровяные часы (на основе 391 CpGs).

Согласно эпигенетическим часам пан-ткани, временный OSKMLN значительно (двусторонняя модель смешанного эффекта, значение P = 0,023) обратил возраст метилирования ДНК (средняя разница в возрасте = -3,40 года, стандартная ошибка 1,17). Эффект омоложения был более выраженным в эндотелиальных клетках (средняя разница в возрасте = -4,94 года, SE = 1,63, рис. 1i), чем в фибробластах (средняя разница в возрасте = -1,84, SE = 1,46, рис. 1h). Качественно сходные, но менее значимые результаты могут быть получены с помощью эпигенетических часов кожи и крови (общий эффект омоложения -1,35 года, SE = 0,67, значение одностороннего смешанного эффекта P = 0,042 и среднее омоложение в эндотелиальных клетках и фибробластам -1,62 года и -1,07 соответственно).

Опираясь на эти результаты, мы затем проанализировали влияние временного перепрограммирования на различные признаки клеточного физиологического старения. Мы использовали панель из 11 проверенных тестов, охватывающих признаки старения, и выполнили большинство анализов с использованием высокопроизводительной визуализации с одной ячейкой, чтобы зафиксировать количественные изменения в отдельных клетках и сдвиги распределения во всей популяции клеток. Все анализы были выполнены отдельно в каждой отдельной клеточной линии (всего 19 линий фибробластов: 3 молодых, 8 в возрасте и 8 обработанных в возрасте; всего 17 линий эндотелиальных клеток: 3 молодых, 7 в возрасте и 7 обработанных в возрасте). Статистический анализ проводился путем случайной выборки 100 клеток на образец; впоследствии данные были объединены по групповым категориям (подробное описание использованных статистических методов см. в разделе «Материалы и методы»). Контрольные эксперименты выполняли, применяя ту же схему трансфекции с использованием мРНК, кодирующей зеленый флуоресцентный белок (GFP).


Полная версия исследования на английском и с дополнительными материалами доступна в источнике

Да, Админ, не самое просто чтиво)) Это только для спецов. А то и профи. Там еще продолжение на английском! Ты так простодушно об этом пишешь, как будто тут все профессора и кандидаты)

Не, я понял, старение почти победили, спс)